产品目录

本制品是一种使用Oligo(dT)₂₅包被的磁珠，配合优化的缓冲体系，用于稳定、高效、便捷地从总RNA中快速分离纯化出高纯度完整mRNA的试剂盒。

本试剂盒中的BalbMag Oligo (dT)₂₅磁珠粒径约为200nm，浓度约为5mg/mL。每mg磁珠偶联的Oligo (dT)₂₅约为300-400pmol，每mg磁珠可纯化约2～3μg mRNA。

本试剂盒纯化的mRNA可直接应用于RT-PCR、qPCR、高通量测序、mRNA文库的构建、固相cDNA文库构建、Northern blot分析、RACE等分子生物学实验，还可用于mRNA疫苗的研发等。


一个典型的哺乳动物细胞中，四种主要的大分子的质量和占比为：RNA,～20pg (1%);DNA,~7pg (0.3%);protein,～500pg (20%);polysaccharide (多糖),～2μg (78.7%)。信使RNA (messenger RNA，简称mRNA)约占总RNA质量的4%，核糖体RNA (ribosomal RNA，简称rRNA)约占80%。

组分	50T	200T	800T
BalbMag Oligo (dT)25磁珠	1mL	4mL	16mL
溶液I (结合液)	30mL	120mL	480mL
溶液II (洗涤液)	25mL	100mL	400mL
溶液Ⅲ (洗脱液)	2mL	8mL	320mL

保存：2～8℃，有效期1年。

• BalbMag Oligo (dT)₂₅磁珠长期不使用时，可以-20℃保存，-20℃可以保存更长时间。
  
• 操作过程要严格保证无RNA酶和DNA酶污染。对于操作环境中RNase的去除，推荐使用核酸酶喷雾清除剂以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。
  
• 本制品的所用试剂和耗材都要求是RNase-free和DNase-free的，操作时应小心，避免被污染。如果耗材可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。如果可能有DNase污染，通常高温高压灭菌可以使DNase灭活。
  
• 分装或使用磁珠时，请适当涡旋震荡或反复颠倒以确保磁珠充分混匀。
  
• 磁分离前应适度震荡离心管使磁珠充分分散后再靠近磁场。如果出现磁珠挂壁现象，可以在磁珠聚集后晃动管内液体，使挂壁的磁珠流下。
  
• 请使用推荐的总RNA量。如果总RNA量过大，可能造成磁珠聚集，会影响洗涤进而影响提取获得的mRNA纯度。发生磁珠聚集时，洗涤时需尽量分散磁珠，这样可有效改善提取效果。如果发生磁珠聚集现象，建议在后续实验中适当减少总RNA量。
  
• 由于RNA容易降解，提取获得的mRNA推荐尽快用于RT-PCR等后续实验。如果不能尽快使用，需要-80℃保存。

BalbMag Oligo (dT)₂₅磁珠表面共价修饰了25聚dT序列即Oligo (dT)₂₅，当真核细胞、动植物组织抽提的总RNA与BalbMag Oligo (dT)₂₅磁珠混合后，磁珠表面的寡聚dT序列与mRNA 3'端的poly(A)进行碱基配对而特异性结合，然后在外界磁场的作用下，磁珠与相应溶液可以快速而高效地分离，经洗涤充分去除杂质，最后用洗脱液将mRNA从磁珠上洗脱下来，即可获得高纯度完整mRNA。

图1．BalbMag磁珠法mRNA纯化剂盒的工作原理示意图。


本试剂盒具有提取效果稳定、纯度高、速度快、操作便捷等优点。本试剂盒的mRNA提取体系经过反复测试和优化，能分离纯化获得总RNA中90%以上的mRNA。仅需孵育、洗涤、洗脱等简单的操作，整个纯化过程不超过15分钟即可完成。所有操作都在同一个离心管中完成，操作便捷。细胞中提取的total RNA使用本制品进行mRNA的纯化效果参考图2。

图2.本试剂盒用于从总RNA纯化mRNA的效果图。使用柱式动物RNA提取试剂盒提取293T细胞的总RNA，再使用本制品进行mRNA的纯化，然后使用一步法荧光定量RT-PCR试剂盒(SYBR Green)进行qRT-PCR检测，使用Actin、B2M和GAPDH三种内参引物对比总RNA (Total RNA)和纯化的mRNA的Ct值。图中可见mRNA纯化前后的Ct值基本一致，说明mRNA的纯化效果接近100%。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

• 准备工作。
  
  • 溶液I (结合液)和溶液II (洗涤液)使用前平衡至室温。溶液Ⅲ (洗脱液)在使用前置于冰上或者2～8℃保存。如果溶液I (结合液)或溶液II (洗涤液)有沉淀，适当水浴或者振荡溶解。
    
  • BalbMag Oligo (dT)₂₅磁珠的准备。
    
    • 将磁珠溶液从4℃冰箱取出，适当涡旋震荡或反复颠倒以确保磁珠充分混匀。参考下表，根据总RNA量和样品数量，取适量的BalbMag Oligo (dT)₂₅磁珠悬液至一洁净离心管中。
      

      Total RNA	Beads required	Solution I for Wash
      1～10μg	20μL	200μL each time
      10～30μg	40μL	200μL each time
      30～50μg	100μL	200μL each time

    • 无论磁珠用量多少，按照每个样品200μL溶液I (结合液)的量，加入适量溶液I (结合液)洗涤磁珠，用移液器轻轻吹打重悬磁珠。置于磁力架上分离30秒，去除上清。重复本步骤1次。
      • 如果样品数量超过5个，可以考虑将适量磁珠悬液先直接置于磁力架上分离30秒，去除上清，然后根据样品数量再加入适量溶液I (结合液)洗涤2次。
    • 按照每个样品100μL溶液I (结合液)的量，加入适量溶液I (结合液)重悬磁珠。
• 从Total RNA中纯化mRNA (以Total RNA的量为20μg为例)。
  
  • 取100μL含有20μg Total RNA的样品与100μL溶液I (结合液)混合。
    注：如果20μg Total RNA不足100μL，可以用DEPC水或其它适当Nuclease-free溶液补足至100μL。
    
  • 65℃孵育2分钟以打开RNA的二级结构，孵育结束后迅速置于冰上。
    
  • 将该200μL混合液与100μL洗涤后的磁珠在室温下旋转混合5分钟。
    
  • 置于磁力架上分离1分钟，去除上清。
    
  • 室温下用200μL溶液II (洗涤液)洗涤磁珠，磁分离30秒，去上清。重复本步骤1次。
    
  • 根据后续实验需求，进行mRNA的洗脱：
    
    • 从磁珠上洗脱mRNA：加入10～20μL溶液Ⅲ (洗脱液)或Nuclease-free的水，如DEPC水或无菌无酶超纯水，75～80℃孵育2分钟，磁分离30秒，然后将上清转移到新的Nulcease-free的离心管中，置于冰上待用。
      • 建议转移上清时保留少量液体以免吸到磁珠影响后续实验。纯化获得的mRNA极易降解，建议尽快进行后续实验。短时间内不使用，请置于-80℃保存。
    • 如果mRNA不洗脱直接用于后续实验，如固相cDNA文库构建等，用后续实验中相应的缓冲液再洗涤一次，即可用于后续实验。

相关搜索：磁珠法mRNA纯化试剂盒，mRNA纯化，磁珠法，mRNA提取，Oligo(dT)25，BalbMag mRNA Purification Kit with Magnetic Beads